Introducción a la cromatografía

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes de una mezcla se distribuyen entre dos fases, una fase estacionaria y una fase móvil. 

Fue inventada en 1903 por el botánico ruso Mikhail Tsvet, quien utilizó la cromatografía para separar pigmentos de plantas como la clorofila y los carotenos. La palabra cromatografía proviene del griego 'chroma' que significa color y 'graphein' que significa escribir, debido a que Tsvet usó la técnica para separar compuestos coloreados.

La cromatografía funciona pasando una mezcla a través de una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido. Los distintos componentes de la mezcla interactúan de forma diferente con la fase estacionaria, causando que se separen a medida que son arrastrados por el movimiento de la fase móvil. 

Existen varios tipos de cromatografía que se diferencian por el estado físico de la fase móvil y la fase estacionaria:

- Cromatografía en columna: La fase estacionaria es un sólido empacado en una columna y la fase móvil es un líquido.

- Cromatografía de papel: La fase estacionaria es una hoja de papel y la fase móvil es un líquido.

- Cromatografía de gases: La fase móvil es un gas y la fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

- Cromatografía de líquidos: Tanto la fase estacionaria como la móvil son líquidos.

La cromatografía se ha convertido en una técnica indispensable para separar y analizar mezclas complejas en campos como la química, bioquímica, medicina, ciencia forense, entre otros.

Principio de separación

La cromatografía separa las mezclas en componentes individuales mediante la migración diferencial de los analitos bajo la influencia de una fase móvil y una estacionaria. La separación se produce porque los distintos analitos interactúan de forma diferente con la fase estacionaria y, por tanto, migran a través del sistema a velocidades diferentes. 

La fase móvil fluye a través del sistema cromatográfico, arrastrando la mezcla de la muestra. La fase estacionaria se fija en el sistema. A medida que la muestra interactúa con la fase estacionaria, los analitos se someten a repetidos pasos de sorción y desorción, lo que ralentiza su avance en diferentes grados en función de sus afinidades específicas. Los analitos con mayor afinidad por la fase estacionaria pasan más tiempo adsorbidos en la superficie y tardan más en migrar a través del sistema. Los analitos con menor afinidad pasan poco tiempo en la fase estacionaria y se mueven más rápidamente con el flujo de la fase móvil.

Esta migración diferencial separa la mezcla inicial en zonas o bandas distintas que contienen los componentes individuales. Los compuestos con afinidades similares forman bandas estrechas y se separan eficazmente, mientras que los compuestos con afinidades muy diferentes se distribuyen ampliamente por todo el sistema. Las bandas separadas se dirigen en secuencia al detector, lo que permite la identificación y cuantificación de los analitos.

Fase móvil

La fase móvil es uno de los dos componentes de la cromatografía que permite la separación de mezclas. Se desplaza a través del sistema cromatográfico, pasando sobre la fase estacionaria y transportando los componentes de la mezcla a separar.

La fase móvil puede ser un líquido o un gas, dependiendo del tipo de cromatografía que se realice. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un disolvente líquido o una mezcla de disolventes. Las fases móviles comunes para la cromatografía líquida incluyen mezclas de agua con metanol o acetonitrilo. En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas portador inerte, normalmente helio, nitrógeno o hidrógeno.

La fase móvil desempeña varias funciones importantes en cromatografía:

- Transporta los componentes de la muestra a través del sistema. Los componentes se disuelven o son arrastrados por la fase móvil a medida que ésta fluye por la columna.

- Impulsa la separación. Los componentes tienen diferentes solubilidades y afinidades por la fase móvil frente a la fase estacionaria. Esto hace que se muevan por el sistema a velocidades diferentes, lo que conduce a la separación.

- Influye en las interacciones. Las propiedades de la fase móvil, como la polaridad, pueden afectar a la intensidad con que los componentes interactúan con la fase estacionaria y, por tanto, a sus tiempos de retención.

- Mejora la eficacia. Mantener un caudal óptimo de fase móvil ayuda a maximizar la eficacia de la separación.

La composición y las propiedades de la fase móvil son consideraciones clave a la hora de desarrollar una separación cromatográfica. Su naturaleza influye directamente en los tiempos de retención y en el rendimiento de la separación. Seleccionando la fase móvil adecuada, los analistas pueden afinar el proceso de separación para un análisis determinado.

Fase estacionaria

La fase estacionaria es un componente vital en cromatografía que permite la separación de los componentes de una mezcla. Se refiere al material fijo o soporte sólido recubierto sobre la columna o sobre el que se adsorbe la fase líquida estacionaria.  

Mientras la fase móvil se desplaza por el sistema, los analitos se dividen entre las fases móvil y estacionaria a diferentes velocidades en función de su afinidad relativa por las dos fases. Esta partición diferencial es lo que proporciona el poder separador de la cromatografía.

La fase estacionaria proporciona el entorno químico para el proceso de separación. Sus propiedades, como el área superficial, el tamaño de las partículas, el tamaño de los poros y la química de la superficie, determinan las características de retención y la eficacia de la separación. La fase estacionaria puede ser un material sólido como la sílice o la alúmina, o un medio líquido recubierto sobre un soporte sólido. La selección de la fase estacionaria depende de la muestra y de los analitos a separar.

Algunos aspectos clave de la fase estacionaria son:

- Está fija en su lugar y no se mueve. La fase móvil fluye a través de la fase estacionaria transportando la mezcla de la muestra.

- Puede ser un sólido, un líquido o una combinación de ambos recubiertos sobre un soporte sólido como sílice, perlas de polímero, etc.

- Proporciona el entorno de separación en función de la afinidad relativa de los analitos hacia ella en comparación con la fase móvil.

- Propiedades como el área superficial, la polaridad, el tamaño de las partículas, etc. determinan la eficacia de la separación.

- La elección de la fase estacionaria adecuada es fundamental para la separación eficaz de los analitos en una mezcla.

La fase estacionaria, junto con la fase móvil y las propiedades de la columna, define las características de retención y permite la separación de componentes por cromatografía. Su diseño y selección es, por tanto, una consideración importante en cualquier análisis cromatográfico.

Retención cromatográfica 

La retención cromatográfica se refiere al tiempo que un compuesto permanece interactuando con la fase estacionaria durante el proceso de separación cromatográfica. Este tiempo de retención depende de la fuerza de interacción entre el compuesto y la fase estacionaria. 

Los compuestos que interactúan más fuertemente con la fase estacionaria se mueven más lentamente a través de la columna cromatográfica, mientras que los compuestos con interacciones más débiles se mueven más rápidamente. Cada compuesto tiene un tiempo de retención característico bajo unas condiciones cromatográficas dadas.

El tiempo de retención es una propiedad muy útil en cromatografía, ya que permite la identificación de los distintos componentes de una mezcla. Al comparar los tiempos de retención de los picos de una muestra con los de standards puros, se pueden identificar los compuestos presentes en la muestra.

En resumen, el tiempo de retención cromatográfico está determinado por la fuerza de interacción entre los analitos y la fase estacionaria, y permite la separación e identificación de los componentes de una mezcla compleja.

Eficacia de separación

La eficacia de separación en cromatografía se refiere a la capacidad de la columna cromatográfica para producir picos estrechos y bien resueltos durante el proceso de separación. Es una medida de la nitidez de los picos y del ensanchamiento de las bandas. El concepto clave es la "teoría de placas". 

Puede considerarse que las columnas cromatográficas contienen una serie de "platos teóricos". Cada plato contribuye a la separación en la columna. Cuantos más platos teóricos tenga una columna, mejor será la separación entre analitos.

El número de platos teóricos es una medida cuantitativa de la eficacia de la separación. Una columna con más platos teóricos podrá lograr una mejor separación entre analitos. Los picos serán más estrechos y estarán mejor resueltos.

El número de platos teóricos depende de las propiedades de la columna cromatográfica, como el tamaño de las partículas, la longitud y el diámetro de la columna. Las columnas que producen picos estrechos y una buena separación entre analitos tienen un número elevado de platos teóricos.

En resumen, la eficacia de separación describe la capacidad de la columna para producir picos nítidos y estrechos. Un mayor número de platos teóricos conduce a una mejor separación. El número de platos teóricos depende de las propiedades de la columna y de los parámetros del sistema. Elegir las propiedades óptimas de la columna y las condiciones cromatográficas es clave para lograr una buena eficacia de separación.

Ensanchamiento de banda 

El ensanchamiento de banda se refiere al ensanchamiento de los picos cromatográficos a medida que los componentes de la muestra se desplazan por el sistema cromatográfico. Esto reduce la resolución entre picos adyacentes y la eficacia global de la separación. Existen varias causas de ensanchamiento de banda:

- Difusión: A medida que los componentes de la muestra migran a través de la columna cromatográfica, se difunden de forma natural alejándose de la banda central. Esta difusión hace que la banda se ensanche con el tiempo.

- Diseño del instrumento: El tubo, los accesorios y el volumen de la celda del detector contribuirán a la ampliación de los picos. Los tubos de mayor diámetro y las celdas de mayor volumen permitirán una mayor difusión.

- Efectos de la temperatura: Los gradientes de temperatura dentro de la columna pueden hacer que el soluto se mueva más rápido en las regiones más calientes, extendiendo la banda.

- Interacciones de soluto: Las interacciones atractivas entre las moléculas de soluto y la fase estacionaria pueden ralentizar algunas moléculas más que otras, ampliando la banda de soluto.

- Velocidad de flujo: Las velocidades de flujo elevadas acortan el tiempo de interacción del soluto con la fase estacionaria, lo que da lugar a una menor separación y a picos más anchos.

Para minimizar el ensanchamiento de la banda, los sistemas de cromatografía se diseñan con tubos estrechos, celdas de detección pequeñas y un control preciso de la temperatura. El caudal, la longitud de la columna y el tamaño de las partículas también se optimizan para obtener picos estrechos y bien resueltos. El equilibrio adecuado de la columna y la preparación de la muestra también son fundamentales para mantener la eficacia de la separación.

Propiedades de la columna

Las propiedades de la columna cromatográfica tienen un impacto significativo en la separación y el análisis de las muestras. Algunos aspectos clave a tener en cuenta son:

Longitud de la columna - Las columnas más largas generalmente proporcionan una mejor separación de los analitos. Sin embargo, esto también aumenta el tiempo de análisis. Las longitudes típicas oscilan entre 10 y 30 cm.

Diámetro de la columna - Los diámetros estándar son de 4,6 o 2,1 mm. Los diámetros más estrechos ofrecen mayor eficacia pero menor capacidad de muestra. Los diámetros más anchos tienen mayor capacidad pero menor resolución.

Tamaño de las partículas - La mayoría de las columnas utilizan partículas de entre 3 y 10 μm. Las partículas más pequeñas proporcionan una separación superior pero aumentan la contrapresión. Las partículas más grandes se utilizan para análisis más rápidos. 

Recubrimientos de la columna - El material y el grosor del recubrimiento de la fase estacionaria influyen en la retención y la selectividad del analito. Los revestimientos más comunes son C18, C8, resinas de intercambio iónico, etc.

Control de temperatura - Muchos sistemas permiten regular la temperatura de la columna. Las temperaturas más altas reducen la viscosidad y disminuyen los tiempos de retención. Sin embargo, esto puede reducir la separación.

En resumen, factores como partículas más pequeñas, revestimientos más finos, columnas más largas y temperaturas más bajas mejoran la eficacia de la separación. Pero esto tiene el coste de aumentar el tiempo de análisis y la contrapresión. Optimizar estos parámetros es clave.

Tipos de detectores

Los detectores cromatográficos permiten identificar y cuantificar los compuestos una vez que han sido separados por el sistema cromatográfico. Existen varios tipos comunes de detectores:

- Detectores UV - Detectan los compuestos por su absorción de la luz ultravioleta. La cantidad de absorción puede utilizarse para cuantificar la cantidad de un compuesto presente. Los detectores UV son baratos, pero sólo pueden detectar compuestos que absorben luz UV.

- Detectores de fluorescencia - Detectan compuestos fluorescentes excitándolos con una longitud de onda de luz y midiendo la emisión en una longitud de onda diferente. Son muy sensibles, pero sólo pueden detectar compuestos fluorescentes.

- Detectores de espectrometría de masas - Identifican los compuestos ionizándolos y midiendo su relación masa-carga. Proporcionan la mayor información sobre la identidad de los compuestos, pero son caros. 

- Detectores de índice de refracción - Miden el cambio de índice de refracción entre la fase móvil y los compuestos. Pueden detectar cualquier compuesto, pero su sensibilidad es baja.

- Detectores electroquímicos - Detectan compuestos que pueden oxidarse o reducirse en un electrodo. Muy sensibles pero sólo para compuestos electroactivos.

La elección del detector depende de los compuestos que necesite analizar y del tipo de información requerida. Los detectores UV y de espectrometría de masas proporcionan la mayor información para análisis desconocidos. Los detectores de fluorescencia proporcionan una alta sensibilidad para compuestos objetivo conocidos. Los distintos detectores proporcionan información adicional sobre los compuestos separados.

Aplicaciones de la cromatografía

La cromatografía es una técnica analítica ampliamente utilizada con numerosas aplicaciones en diversos campos. Algunas de las principales aplicaciones son:

Química Analítica

- Se utiliza para el análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas químicas. Permite separar, identificar y determinar los compuestos presentes en una muestra.

- La cromatografía de gases y la cromatografía de líquidos de alto rendimiento se utilizan habitualmente para el análisis de compuestos orgánicos e inorgánicos. 

- La cromatografía iónica se utiliza para determinar aniones y cationes.

- Muy utilizada en laboratorios forenses para analizar muestras relacionadas con investigaciones criminales, como drogas, toxinas, etc.

Bioquímica 

- Se utiliza para la separación y el análisis de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas mediante técnicas como la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico, etc.

- La cromatografía de afinidad utiliza interacciones biológicas únicas y se emplea para la purificación de enzimas y proteínas recombinantes. 

- Se utiliza habitualmente en estudios de proteómica.

Industria

- Se utiliza para el control de calidad de materias primas y la supervisión de procesos industriales.

- Purificación y análisis de candidatos a fármacos. Control de calidad rutinario de fármacos y formulaciones farmacéuticas.

- Separación de diversos componentes de combustibles como la gasolina, el combustible para aviones, etc.

- La industria alimentaria y de bebidas lo utiliza para el análisis de componentes alimentarios.

- Los principios son los mismos, pero la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía de líquidos (LC) se utilizan para distintos tipos de análisis en función de la aplicación. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la más utilizada en múltiples campos.